本生闡述：牛血清白蛋白的應用

　　本生闡述：牛血清白蛋白的應用

　　牛血清白蛋白(BSA)在生化實(shí)驗中有廣泛的應用, 例如在WB實(shí)驗中加入BSA, 通過(guò)提高溶液中蛋白質(zhì)的濃度，對酶起保護作用。防止酶的分解和非特異性吸附，能減輕有些酶的變性，減輕不利環(huán)境因素如加熱，表面張力及化學(xué)因素引起的變性的。具體的WB實(shí)驗操作和BSA在實(shí)驗中的應用分享如下

　　方法/步驟

　　測定蛋白濃度

　　按50：1配置BCA工作液。10ulC液(蛋白標準)+90ulPBS液稀釋成0.5mg/ml的蛋白標準液。再分別以0、1、2、4、8、12、16、20ul將蛋白標準液加入96孔板的第1~8標準孔中，在其他樣品孔中加入10ul待測樣品。分別加PBS定容至20ul。各孔中加入200ulBCA工作液，室溫放置2小時(shí)。用酶標儀測定蛋白濃度：測定A562，依標準曲線(xiàn)算出蛋白濃度。

　　SDS-PAGE電泳

　　1 制 膠: 按比例配制分離膠，緩緩地搖動(dòng)溶液，使激活劑混合均勻，將凝膠溶液平緩地注入兩層玻璃極中，再在液面上小心注入一層水，以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液中，靜置40min。同前按比例配制濃縮膠，但混勻溶液時(shí)不要過(guò)于劇烈以免引入過(guò)多地氧氣。吸去不連續系統中下層分離膠上的水分，連續平穩的注入凝膠溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齒尖留有氣泡，靜制60min以上以保證*聚合。

　　2 預電泳： 將聚合好的凝膠安置于電泳槽中，小心拔去梳子，加入電泳緩沖液后低電壓10-20V的預電泳20-30min。(目的是清除凝膠內的雜質(zhì)， 疏通凝膠孔徑以保證電泳過(guò)程中電泳的暢通)。

　　3 樣品準備：首先計算上樣體積，然后按樣品：上樣buffer=4：1的比例加入上樣bufer混勻，沸水煮10分鐘，冰上5分鐘。

　　4 加 樣： 預電泳后依次加入標準品(Marker)和待分析樣品。(加樣時(shí)間要盡量短，以免樣品擴散，可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液避免邊緣效應。每個(gè)泳道加5ul 。

　　5 電 泳： 加樣完畢，選擇80V恒壓進(jìn)行電泳，電泳直至溴酚藍染料前沿到達兩膠交界處(一般約20分鐘)，更換至100V恒壓電泳，電泳直至溴酚藍染料前沿下至凝膠末端處，即停止電泳(一般約為1小時(shí)20分鐘)。

　　膜的封閉

　　用TBST液洗滌印跡膜10分鐘x2次。放入5%BSA(abs49001012)封閉液內，搖床震動(dòng)，70轉/分鐘，室溫封閉1小時(shí)30分鐘。

　　蛋白質(zhì)的樣品制備

　　取心肌組織50mg，待組織塊自行溶解，用濾紙吸去其表面水分，將組織塊放入玻璃勻漿器球狀部位，用組織剪盡量將其剪碎，將剪碎的心肌組織放入玻璃勻漿器的桿狀部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌組織的比例加入RIPA和PMSF(先加RIPA再加PMSF)，將玻璃勻漿器插入冰中，勻漿約30分鐘。

　　將心肌組織勻漿轉移到離心管中，4℃12000g離心5分鐘，收集上清(如有粘稠物進(jìn)一步用超聲處理)，樣品分裝凍存于-20℃備用。

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