樣本的收集及保存操作不當會(huì )影響ELISA實(shí)驗結果嗎？

　　樣本的收集及保存操作不當會(huì )影響ELISA實(shí)驗結果嗎？

　　本生ELISA(酶聯(lián)免疫試驗)以其靈敏度較高、特異性好的特點(diǎn)已廣泛用于科研實(shí)驗及臨床，越來(lái)越多科研單位選擇用ELISA實(shí)驗方法完成研究課題。優(yōu)*的試劑、好的儀器和正確的操作是保證ELISA試劑盒檢測結果準確可靠的必要條件，但樣本的收集及保存操作不當也會(huì )影響ELISA實(shí)驗結果。樣本的收集跟保存聽(tīng)上去貌似很簡(jiǎn)單，但不乏有許多科研工作者因為樣本的收集跟保存沒(méi)做好而影響實(shí)驗結果。

　　下面針對樣本收集及保存提幾點(diǎn)建議：

　　1.嚴重溶血，以HRP為標記的ELISA測定中，殘留在孔內的血紅蛋白具有過(guò)氧化物酶樣活性，催化底物顯色造成假陽(yáng)性;

　　2.混有紅細胞的血清易沉淀或附著(zhù)在聚乙烯孔內不易洗凈;如有細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP，也會(huì )產(chǎn)生假陽(yáng)性反應：

　　3.標本凝固不全，有時(shí)為了爭取時(shí)間快速檢測，常在血液還未開(kāi)始凝固時(shí)即強行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過(guò)程中可以形成肉眼可見(jiàn)的纖維蛋白塊，易造成假陽(yáng)性結果;

　　4.采血試管洗滌不、反復使用易交叉污染：塑料試管能吸附抗原物質(zhì)，樣本久置在塑料管內會(huì )使樣本內抗原含量下降造成假陰性。

　　血清標本宜在新鮮時(shí)檢測，嚴重溶血標本禁用。一般說(shuō)來(lái)，在5天內測定的血清標本可放置于4℃，標本在冰箱中保存時(shí)間過(guò)長(cháng)導致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深。超過(guò)一周測定的需-20℃保存。凍結血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢吮緫入x心或過(guò)濾，澄清后再檢測。反復凍融會(huì )使抗體效價(jià)跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存;使用一次性玻璃試管或真空管采血管;并使用非抗凝標本，肝素抗凝血漿會(huì )增加OD值，可能與高濃度肝素具有強大的負電荷能吸附酶標記物不易洗脫有關(guān);EDTA、酶抑制劑(如NaN3)可抑制ELISA系統中辣根過(guò)氧化物酶活性;血液標本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標本采集時(shí)用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當的促凝劑。

　　被檢血清或血漿標本，可用含保護性封阻劑(吐溫-20)或稱(chēng)濕潤劑的緩沖液來(lái)稀釋。也可加入一些蛋白質(zhì)，如1%牛血清白蛋白等來(lái)稀釋。然后再加到已經(jīng)用抗原或抗體包被的固相載體中進(jìn)行孵育。此種被試標本可作一系列稀釋度測定，也可用一個(gè)稀釋度測定。對于作某一個(gè)傳染病的診斷來(lái)說(shuō)，最好先用一系列稀釋度作一批標本測定，求出對診斷有意義的一個(gè)稀釋度(即測定劑量反應曲線(xiàn))，然后用一個(gè)稀釋測定即可。最適稀釋度和孵育時(shí)間均需從實(shí)踐中摸索出來(lái)，對一般病原微生物所引起的傳染病的血清學(xué)診斷，以1：200稀釋度測定比較適當，而試驗標本的(即含抗體)作用時(shí)間一般為室溫或37℃ 1-2小時(shí)。但現在對有些標本(如流腦抗原)測定時(shí)，僅用37℃ 5分鐘。對單克隆抗體檢測也可縮短作用時(shí)間。

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